实验方法实验工具变量说明数据收集实验步骤

下面是好好范文网小编收集整理的实验方法实验工具变量说明数据收集实验步骤，仅供参考，欢迎大家阅读！

一．制胶

1. 安装制胶装置

步骤1. 玻璃板及制胶装置用前清洗干净，晾干。

步骤2. 保证两块玻璃板下缘水平且均无豁口，安装玻璃板（内长外短），用手压实玻璃板及垂直槽制胶架。

步骤3. 倾斜垂直槽制胶架子装入垂直槽制胶固定架（为防止胶片变形漏液体，不要过分用力下压），卡好。

2. 配制分离胶

注：加完TEMED后立即混匀铺板；加入＞75%玻璃板高度的分离胶，可适当高，以防漏液。

3. 铺板，水封（ddH2O），最好用无水乙醇铺满。

4. 胶凝后（可以观察到明显的分界线或剩余分离胶已凝），倒掉无水乙醇，用ddH2O轻轻冲洗，可直立胶板倒掉多余的水。

5. 配制浓缩胶（2板约3ml）

6. 上胶并插梳子（水平迅速，不能有气泡），先弃无水乙醇，再水洗后弃水。

7. 浓缩胶凝固后从制胶架上拆下，冲洗干净漏出胶体，完全浸入ddH2O 4℃冰箱过夜。（胶可现做现用，但是放置时间越长，跑电泳效果越好）

二．配液

配制电泳液，转膜液，TPST及5％脱脂奶粉（跑电泳前一天完成配胶及实验相关液体配制）

三．跑电泳

步骤1. 安装电泳槽，注意使用主板（有两个个金属电极），玻璃板（检查玻璃板是否干净）安装梳子对梳子，不要将梳子压在胶片上（否则影响拔梳子）。

步骤2. 放入冰袋，倒入电泳液（先倒电泳槽中间，由中间流向四周，中间电泳液必须使用新液）。

步骤3. 取出蛋白样品，上样前离心。

步骤4. 拔梳子（水平缓慢拔起），用枪头吸吹（电泳液，枪头不要插入两个玻璃板之间，贴长板吹，缓慢温柔）各槽去除多余胶。

步骤5. 上样，先上marker，两侧上marker，每孔6ul。加样时注意正反，不要加入气泡。

每孔最多加30ul（通常上样量为40ug 20ug，如需加30ul，需要先加15ul沉淀一下，再加15ul）。

步骤6. 装电泳槽盖（红对红，黑对黑），80V，到达分离胶时120V，60V恒压（注意是否有电流，通常电流为20多mA，功率为1-2W）将样品压入分离胶（通常起始分离胶与样品距离0.5cm为最佳）。

步骤7. 调整电压至100V，继续电泳至完成。

四．转膜

步骤1. 切胶并转移至电转液中。

步骤2. 按如下顺序安装转膜槽样品夹板

黑板（最下方）→海绵垫→滤纸→胶→PVDF膜（甲醇提前浸泡激活，30s）→滤纸→海绵垫→白板→上扣（逐层用滚轮压实）

步骤3. 电转槽安装（放入冰中，冰袋至于槽中，夹板与转膜槽黑对黑，红对红），加入电转液，液面超过PVDF膜。恒流

电转条件：

步骤4. 电转完毕后，剪膜，注意正反面。

五．免疫反应部分

步骤1. TPST（1×）清洗5-10min。

步骤2. 5％脱脂牛奶封闭（脱脂奶粉提前配好，防治封闭不均匀），室温2小时（摇床）或4℃过夜。磷酸化蛋白用5％BSA封闭。

步骤3. TPST（1×）洗膜3次，每次10min

步骤4. 一抗4℃封闭过夜（最佳）or 室温摇床2h。GAPDH工作浓度（1：5000）。一抗用5％脱脂牛奶配制（磷酸化蛋白用5％BSA配制）。

步骤5. 过夜后一抗摇0.5小时（一抗回收储存于-20℃），TPST（1×）洗膜3次，每次10min

步骤6. 二抗室温摇床封闭2h（5％脱脂牛奶配制）。工作浓度（1:5000）

步骤7. TPST（1×）洗膜3次，每次10min（打开ECL显色仪预冷，更换好CL板，打开软件）

步骤8. PVDF晾干备用

步骤9. 配制ECL显色液（A液：B液为1：1，避光，一张膜500ul），配完后30min内使用。

六．ECL发光

备注： 因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。