广工检测原理实验报告_老师，这是我的满分实验报告！

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一、实验原理

凝胶迁移或电泳迁移率实验 (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析(Hellman LM and Fried MG, 2007)。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前也可用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用 (Rio, 2018)。

在实验中，通常将纯化的蛋白或细胞粗提液和生物素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。其中DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢，而探针移动的较快。

图1 EMSA原理图

二、实验目的

对探针和蛋白进行互做验证

三、主要仪器

DYCP-32A核酸电泳仪

GNP-9080型恒温培养箱

GL-21M型高速冷冻离心机

DK-42恒温水浴锅

Forma3111型细胞培养箱

JY92-IIN型细胞超声破碎仪

ZQWY-200型恒温振荡器

四、实验步骤

样本制备

探针标记及检测

形成蛋白-探针复合物

制备凝胶、电泳

转膜

检测

五、课后习题及解答

1.研究蛋白-核酸互作有哪些技术？

答：凝胶电泳迁移率（EMSA）、染色质免疫沉淀（ChIP）、RNA Pull Down / DNA Pull Down、双荧光素酶报告基因、酵母单杂交。

2、为什么实验背景高？

答：1）TBE溶液中有悬浮物；2）曝光或者成像时间过长；3）蛋白的质量不高，杂质多；4）没有清洗干净；5）实验过程中膜没有一直处于湿润状态；6）封闭时间不足或者效率不高。

3、探针的存储条件？

答：为防止探针降解，探针应保存在 -20 ℃。

4、为什么看不到迁移带？

答：1）蛋白降解或者提取量不足；2）标记的DNA探针量太少或者样本中没有可以与探针结合的蛋白；3）探针降解或者探针与蛋白无特异性互作；4）曝光或成像时间过短；5）转膜效率低或者未转过来。

5. Western Blot和EMSA有什么不同的意义

答：Western Blot 只能反应含量，不能反应待测分子的生物学活性。EMSA是蛋白分子与靶序列核酸的结合量，反应的是该分子的生物学活性。

6.在DNA探针的选择上，要考虑哪些重要因素？

答：1）目的DNA的长度应小于300bp；2） 如目的蛋白已被鉴定，应该使用短的寡核苷酸片段；3）长的限制性酶切片段可用于对特定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位 。

六、考试重点

1.金开瑞EMSA技术金开瑞EMSA技术

金开瑞提供EMSA检测技术服务，帮助您检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。

2技术流程技术流程

接收订单及样品 、实验设计、合成探针、EMSA电泳凝胶配置、EMSA反应、电泳检测、显色反应 、结果交付

3客户提供

1.需提取核蛋白的细胞＞107，动物组织不少于400 mg，植物组织不少于2 g，建议客户在金开瑞表达重组蛋白；

2.探针序列；如使用结合蛋白特异性抗体，抗体50 μL以上，浓度大于0.5 mg/mL。

4 最终交付

实验报告，含完整的实验流程、实验结果数据及图片。

七、课外延伸

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八、参考文献

Hellman LM and Fried MG, 2007. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols, 2(8):1849-61.

Rio DC, 2018. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.Cold Spring Harb Protoc, (4):435-40.