动物生物学实验报告

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四川农业大学

动物微生物学及免疫学教学实践实验报告

大肠杆菌与沙门氏菌混合感染的猪病料病原菌的

分离与鉴定

专 业： 动物医学

班 级: 组 别 ： 第 一 组 指 导 教 师：

二○一○年六月

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目录索引

一 培养基的制备............................................................4 二 病料接种、培养及细菌抹片的制备和G染色...................................5 三 细菌的纯培养、移植和细菌抹片的制备及G染色...............................6 四 TSI培养基培养及生化鉴定................................................7 五 实验结果...............................................................10 六 讨论及结论.............................................................11

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一 培养基的制备

﹝目的要求﹞

掌握一般培养基的制备原则和要求；熟悉一般培养基的制备过程；掌握培养基酸碱度的测定。 ﹝实验材料﹞

（1）器皿：量筒（100ml两个）、烧杯（100ml和1000ml各一个）、漏斗（两个）、三角烧瓶（100ml两个）、试管（七支）、玻璃棒（两根）、玻璃平皿、刻度吸管（1ml和10ml各两个）、PH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试管塞、扎绳、包装纸、洗耳球、酒精灯。

（2）试剂：牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，磷酸氢二钾，琼脂条或粉，0.1mol/L和1mol/L的氢氧化钠、0.1mol/L的盐酸溶液、蒸馏水、麦康凯琼脂粉、三塘铁琼脂粉。

﹝方法内容﹞

（1）按下表计量称取各种试剂（先称取盐类再称取蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 1.0g

（2）普通琼脂：原料称量（按配方）—→溶解—→调节PH—→塞棉塞和包扎—→灭菌 麦康凯琼脂：原料称量（按配方）—→溶解—→装入盐水瓶—→塞棉塞和包扎—→灭菌 三塘铁琼脂：原料称量（按配方）—→溶解—→分装入试管—→塞棉塞和包扎—→灭菌 （3）培养基的分装：用玻璃漏斗、橡皮管、小玻璃管及弹簧夹制作分装装置—→选用15×150平口试管或300ml锥形瓶—→分装（每管约10ml）

（4）棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎 分别制作试管和锥形瓶的棉塞并塞好，再用干洁的报纸将其头部包扎好。

（5）培养基的灭菌 将培养基置于高压蒸汽锅内，121℃灭菌15至30min。

（6）TSI斜面、普琼和麦康凯琼脂平板的制作 TSI斜面：灭菌后趁热将管口一端搁在玻棒上，使之有一定坡度，凝固后即形成斜面。普琼和麦康凯琼脂平板的制作：普通琼脂和麦康凯琼脂以手掌感触，若将琼脂瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持时，即为倾倒平皿的合适温度。每只灭菌培养皿倒10到15ml将皿盖盖上，将培养皿与桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即形成普通琼脂平板和

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蛋白胨 2.0g 氯化钠 1.0g 琼脂粉 4.0g 蒸馏水 200ml

麦康凯琼脂平板。

﹝结果分析﹞ 以斜面接种培养验证培养基配置效果；以平板制作及接种24h培养验证24h；

二 病料接种、培养及细菌抹片的制备和G染色

﹝目的要求﹞掌握细菌分离培养的基本要领和方法；掌握厌氧菌培养的原理及方法；掌握细菌抹片的制备方法和G染色法；认识革兰氏染色的反应特性。

﹝实验材料﹞载玻片、火柴、吸水纸、生理盐水、各种染色液、菌种（病料）、剪刀、记号笔、普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、接种环、酒精灯。 ﹝方法内容﹞

1、器械、病料消毒（剪刀、接种环、病料）—→勾取病料—→划线接种 —→培养。

（1）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20°左右的角度（角度越小越好，避免空气污染）。

（2）右手持接种环，分别从已表面消毒的病猪肺、肝、肾中挑取病料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，带接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线。 （3）划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不至划破培养基。 （4）划线中不宜过多的重复旧线，以免形成菌苔。

（5）接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置于37℃培养24h。 注：划线接种于6个普通琼脂平板和6个麦康凯琼脂平板。

2、G染色：涂片—→干燥—→火焰固定—→染色—→水洗—→干燥—→油镜观察 （1）在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸结晶紫溶液，经1~~2min水洗。 （2）加革兰氏碘液于抹片上媒染，作用1—2min，水洗。 （3）加95%的酒精与抹片上脱色，约0.5—1min，水洗。

（4）加稀释的石碳酸复红（或沙黄水溶液）复染10—30s，水洗。

（5）吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

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三 细菌的纯培养、移植和细菌抹片的制备及G染色

﹝目的要求﹞掌握细菌纯培养的基本要领和方法；掌握兼性厌氧菌培养的原理及方法；掌握细菌抹片的制备方法和G染色法；认识革兰氏染色的反应特性。

﹝实验材料﹞载玻片、火柴、吸水纸、生理盐水、各种染色液、菌种（病料）、剪刀、记号笔、普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、接种环、酒精灯。 ﹝方法内容﹞

1、器械、病料消毒（剪刀、接种环、病料）—→勾取单菌落—→染色镜检—→划线接种 —→培养。 （1）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20°左右的角度（角度越小越好，避免空气污染）。

（2）在已培养出单菌落的麦康凯培养基上分别勾取一粉红色单菌落和一淡黄色单菌落，染色镜检，视野均为革兰氏阴性小杆菌或球菌。

（3）右手持接种环，分别勾取粉红色和淡黄色菌涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，带接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线。分别标记、编号两个培养基为A和B。

（4）划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不至划破培养基。 （5）划线中不宜过多的重复旧线，以免形成菌苔。

（6）接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置于37℃培养24h。 注：划线接种于6个普通琼脂平板和6个麦康凯琼脂平板，整个过程无菌操作。 2、G染色：涂片—→干燥—→火焰固定—→染色—→水洗—→干燥—→油镜观察 （1）在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸结晶紫溶液，经1~~2min水洗。 （2）加革兰氏碘液于抹片上媒染，作用1—2min，水洗。 （3）加95%的酒精与抹片上脱色，约0.5—1min，水洗。

（4）加稀释的石碳酸复红（或沙黄水溶液）复染10—30s，水洗。

（5）吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

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四 TSI培养基培养及生化鉴定

﹝目的要求﹞熟悉掌握斜面接种的方法；了解大肠杆菌和沙门氏菌在三塘铁培养基上的培养特性；掌握细菌鉴定中常用生化试验原理和方法；了解细菌生化试验在细菌鉴定及诊断中的重要意义。

1、TSI培养基接种培养

﹝实验原理﹞

本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌(e.coli)，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。

﹝方法步骤﹞

勾取A或B菌单菌落—→染色镜检—→斜面接种—→穿刺接种

穿刺接种：用接种针挑取菌落，垂直刺入培养基内。要从培养基表面中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可（疑似大肠杆菌和沙门氏菌各接种一管），37℃培养24-48h观察。

结果分析：大肠杆菌在斜面和深层均为黄色，而沙门氏菌在斜面为红色，在深层为黄色，若产生H2S有黑色的沉淀。

2、生化试验

（1）糖发酵实验

原理：各种细菌具有不同的酶，有的细菌能分解某些糖类而产酸产气，有的细菌虽能分解某种糖类，但只产酸不产气，，有的细菌则不能分解。借此特点，可以鉴别细菌。

方法：取两组糖发酵管，将糖发酵管甩至两端，标记后折断，每组将A、B菌接种于两套糖发酵管中，倒立37℃培养24h。

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结果分析：产酸产气时，可使培养基的指示剂变色，并可在发酵管内顶端出现气泡；只产酸时仅见发酵管内培养基颜色改变，不见气泡；不分解者无反应。如大肠杆菌分解乳糖产酸产气；用“⊕”表示，金黄色葡萄球菌虽能分解乳糖，但产酸不产气，用“+”表示；沙门氏杆菌不能分解乳糖，用 “一”表示。

（2）VP实验

原理：某些细菌(如产气杆菌、阴沟杆菌：等)，能分解葡萄糖产生丙酮酸，再进一步将丙酮酸脱羧，变为乙酰甲基甲醇。加KoH溶液后，在碱性环境下，乙酰甲基甲醇被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含胍基发生反应，生成红色的化合物。在培养基中加入少量含胍基的化合物(如叽酸或肌酐等)，可以加速这个反应。在加KoH前，先加入a-萘酚，也可提高试验的敏感性。

方法：取两组葡萄糖蛋白胨水，分别接种A菌和B菌培养管中，经37℃培养48h。加入甲液、乙液各一滴，充分摇动培养管，观察结果。

结果分析：如立即或于数分钟内出现橙红色或红色反应者为阳性。不变色者，将培养管放37℃中4h后再进行观察，若仍不变色或仅呈淡褐色者为阴性。产气杆菌为阳性，大肠杆菌为阴性。

（3）甲基红试验（MR实验）

原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸、丙酮酸再被分解，则可产生甲酸、乙酸、琥珀酸、乳酸等，这样使培养基的pH降至4.5以下，这时加入甲基红指示剂呈红色。甲基红指示剂变色范围pH4.4(红色)一6.2(黄色)。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质(如醇、酮、醛、气体和水等)，则培养基的酸度仍在pH6．2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色为阴性。

方法：将A菌和B菌分别接种在两组葡萄糖蛋白胨水中，在37c培养3～4d，加入MR试剂1～2滴，观察反应结果。

结果分析：红色反应为阳性，无色反应为阴性。例如，大肠杆菌和沙门氏菌为阳性，产气杆菌为阴性。

（4） H2S实验

原理：某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸，如半胱氨酸等，生成硫化氢，遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。

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方法：将A菌和B菌分别接种于两组硫化氢生化管上，37℃恒温箱中培养18-24h，观察结果。 结果分析：培养基变黑为阳性，不产生黑色为阴性。例如，沙门氏菌多数菌株为阳性，大肠杆菌为阴性。

（5）枸橼酸盐利用试验

原理：枸橼酸盐培养基中的枸橼酸钠是惟一的碳源。有的细菌(如产气杆菌等)可利用枸橼酸盐作碳源，能在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐，最后产生碳酸盐而使培养基变为碱性。此培养基中的溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，表示枸橼酸盐利用试验阳性。若细菌不能利用枸橼酸盐作为碳源，则细菌不生长，培养基仍保持棕色，表示枸橼酸盐利用试验阴性。

方法：将A菌和B菌分别接种在两组枸橼酸盐生化管上，经37℃培养2—4d后，观察结果。 结果分析：长出菌落，培养基变深蓝色为阳性；细菌不生长，培养基仍为原来的棕色为阴性。例如，沙门氏菌为阳性，大肠杆菌为阴性。

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五 实验结果

1、第二步和第三部菌落观察结果

第一次镜检：视野中充满了红色短杆菌或球菌。 第二次镜检：A菌和B菌均为粉红色短杆菌或球菌。

第一次菌落观察：麦康凯琼脂培养基四周为粉红色中等大菌落，中间一块圆形的小菌落群。第二次菌落观察：A菌菌落为圆形、光滑、湿润、低隆起、粉红色、中等大菌落。 B菌菌落为圆形、光滑、湿润、隆起、淡黄色、小菌落。

2、三塘铁培养鉴定

A菌：从斜面到深层均为黄色，有无色气体产生；

B菌：斜面为黄色，深层为淡黄色，穿刺线有黑色沉淀产生。

3、生化试验结果

表1 分离菌株生化试验结果

菌 种

项目

葡 乳 麦 甘 蔗 H2S MR VP 枸

大肠杆菌 ⊕ ⊕ ⊕ ⊕ ⊕ 一 + 一 一

沙门氏菌 ⊕ 一 ⊕ ⊕ 一 + + 一 ⊕

注：+ 阳性或产酸，⊕产酸产气 ， 一 阴性，R 红色 ，Y 黄色 ，B 黑色

4、结果分析，见第6——第9页结果分析。

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六 讨论与结论

1、通过第一次革兰氏染色，证明了病料中含有革兰氏阴性的短杆菌或球菌；第二次G染色则证

明了成功分离纯化了两种G阴性菌。而A菌菌落在麦康凯上为粉红色菌落，疑似大肠杆菌；B菌菌落在麦康凯上为淡黄色菌落，疑似沙门氏菌。

2、A菌的三唐铁（TSI）培养基培养结果表明A菌能发酵乳糖和葡萄糖并产气，但不产H2S；而

B菌的结果则表明B菌能发酵葡萄糖产酸，产H2S,但不能发酵乳糖。A菌疑似大肠杆菌，B菌疑似沙门氏菌。

3、通过G染色镜检、TSI培养基鉴定、A菌和B菌的生化鉴定结果可以得出结论：A菌为大肠杆

菌，B菌为沙门氏菌。

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