蛋白质组学质谱分析 干货 5000字基于质谱的蛋白质组详细总结
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蛋白质组学目的是解析基因组全部的蛋白质组,并通过蛋白定量和定性上变化反映细胞、器官和有机体的生理变化;转录后调控和翻译后修饰使得组成蛋白的数量远远大于组成基因的数量。
随着生物质谱技术迅速发展,质谱技术已经逐渐成为了蛋白质组学分析的主流技术。
蛋白质的鉴定可以通过其特有肽段的序列来识别,质谱(MS)其扫描速度、灵敏度和分析复杂混合物的能力是一种非常适合分析蛋白质的技术。
其基本原理是通过蛋白质被胰蛋白酶解,然后用液相色谱(LC)的方法对酶解的肽段进行分离,基质辅助激光电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)是常用的对分离肽段离子的检测的方式,然后肽段离子在液相色谱的电离和洗脱,在质谱仪中确定其分子量,质谱仪会进一步分析其碎片的组成。
整个液相和质谱的工作流程就是我们常说的串联质谱(MS/MS),串联质谱识别它特定的氨基酸序列,再通过蛋白数据库及软件的进行分析后,就可以得到蛋白的定性和定量的结果。
Scoring proteomes with proteotypic peptide probes
蛋白质组的研究取决于实验技术策略、质谱的高分辨率和高灵敏度以及定量算法和软件更新;这些方法和技术上为定量蛋白质组学提供了研究手段和技术保障。
传统的蛋白质鉴定的方法:如免疫印迹法、化学测序法、凝胶电泳法通常来说比较费时费力且通量较低,不适合高通量蛋白质组学的研究。质谱技术的出现使得传统技术应用更加广泛,比如二维凝胶电泳的技术与质谱的技术对蛋白进行鉴定(2DE结合MALDI-TOF/MS)。
随着质谱技术的发展,也衍生出一些非二维凝胶电泳的分离技术,例如基于多维液相色谱分离的蛋白鉴定技术(MudPIT)、Top-Down的质谱、以及亚蛋白质组(Sub-proteomics)等等。
我们通常对是否样品进行稳定的同位素标记分为有标定量和无标定量两种方法,本次我们主要通过质谱结合同位素标记和无同位素标记的质谱方式进行总结。
一、 标记定量蛋白质组
1.同位素亲和标签技术
ICAT的方法关键是ICAT实际的应用,该试剂由三部分组成,中间部分称为链接部分,分别是8个氢原子或者重氢原子,前者称为轻链试剂,后者称为重链试剂。
中间部分的一头链接一个巯基的特异反应基团,可以与蛋白质中的半胱氨酸的巯基相连,从而实现对蛋白的标记。另一头连接生物素。用于标记蛋白质或多肽链的亲和纯化。
当采用ICAT技术对蛋白质进行分离和定量时,首先要对蛋白进行标记,然后进行蛋白酶切并对蛋白酶切后的多肽复合物亲和色谱分离,复合物中仅仅被同位素标记的肽段能够进入色谱柱保留,并进行质谱鉴定,其他的大量肽段不被色谱柱保留,通过比较重链和轻链试剂肽段在质谱中的信号强度,可以实现对差异表达蛋白的定量分析。
1) 复合物1(轻链)和复合物2(重链)分别用半胱氨酸标记
2) 混合后进行酶切 亲和纯化 后进行质谱分析
ICAT的优点在在于它可以对混合样本(来自正常和病变的细胞或组织)直接检验并能快速定性和定量鉴定低丰度蛋白,尤其是膜蛋白等疏水性蛋白质,可以快速找出重要的参与疾病的标志物等。
ICAT不但可以用来分析整个细胞的蛋白质组,还可以对线粒体一些专门的亚细胞组分进行定量和检测
2.酶催化 18O 同位素标记法
通常情况下在18O的存在下,酶解蛋白能够产生同位素标记的肽段,最常用的办法是在胰蛋白酶解过程中加入18O,也可以采用Glu-C和Lys-C等中间体的内肽酶,在肽段断裂反应中引入一个氧原子,实现同位素标记。
蛋白质水解过程中两种稳定同位素的合并示意图
蛋白质水解过程中两种稳定同位素的合并示意图
蛋白质在18O标记的水中被胰蛋白酶解,从而使得18O结合到每个肽段片段的碳端
3.同种同位素标签定量法
ICAT标记法我们可以把它归类与一种同位素标签技术,从蛋白定量的分析的角度,ICAT标记法属于对母离子的标记定量;同样可以类比。
蛋白定量依旧可以选择对子离子进行定量,(可以理解母离子就是其中样品中的某一组份,子离子就是该母离子被质谱中的电子轰击出来的碎片离子)即通过化学反应给肽段添加质量标签,在质谱进行二级碎裂时将质量标签碎裂成不同质量的报告离子,利用其不同报告离子的丰度作为不同样本对应肽段或蛋白定量的比值。
同种同位素标签标记法(Isobaric tags for relative and absolute quantification,ITRAQ )主要的原理通过对氨基酸N端和赖氨酸残基进行酶解后进行同位素标记的技术。
ITRAQ试剂是由3个化学集团组成,分别是反应基团、报告基团和平衡基团。反应基团特异与肽段的氨基(肽段的 N 端、赖氨酸的氨基)发生结合反应, 报告基团的质量数是不同的, 加上相应的平衡基团后, 保持 iTRAQ 试剂总的质量数固定,同时保证不同标记的肽段在色谱中的保留时间相同。
由于是等质量的, 被不同标记的肽段在一级图谱中表现为一个母离子峰, 进一步碎裂时, 平衡基团发生中性丢失, 报告基团则会产生相应的不同质量数的报告离子, 比较报告离子的丰度值, 可以得到样本的相对丰度比。目前 iTRAQ 可以同时对 4 个或者 8 个样本进行标记与定量。
2004年发表iTRAQ技术文章A:iTRAQ试剂的结构 B:iTRAQ的报告基团和平衡基团 C: iTRAQ法定量蛋白质原理
TMT(Tandem Mass Tag)技术由美国Thermo Fisher Scientific开发的一种多肽体外标记技术。
该技术采用了6标(TMTsixplex™ Isobaric Label Reagent Set)、10标(TMT10plex™ Isobaric Label Reagent Set )、16标(TMTpro 16plex)同位素标签,通过与肽段特异氨基酸位点相连实现不同来源的肽段标记,然后进行串联质谱分析,监测碎裂下来的标签实现肽段定量。
一次实验可灵活比较最多16种不同样本中蛋白质的相对含量。
TMT实验中,经过蛋白质提取获得组织细胞中的全蛋白,全蛋白在胰酶作用下被酶解成肽段,TMT试剂对所获得的全部肽段进行标记。
TMT试剂主要由3部分组成:报告基团、平衡基团和肽反应基团。以6标试剂为例:报告基团相对分子质量分别为126、127、128、129、130和131;平衡基团相对分子质量分别为103、102、101、100、99和98,这样就形成了6种相对分子质量均为229的等量异位标签。
TMT标签试剂通过肽反应基团与肽段上赖氨酸及N端氨基酸残基相连。被标记肽段经过色谱分离后直接进入串联质谱仪中进行定性及定量检测。
一级质谱中,任何一种TMT试剂标记的不同样品中的同一肽段表现出相同的质荷比;二级质谱中,报告基团、平衡基团、连接基团之间的化学键断裂释放出TMT报告基团和平衡基团。
平衡基团发生中性丢失,报告基团被质谱仪检测并记录,在质谱低质量区产生了10个TMT报告离子峰,其强度反应了该肽段在不同样品中的相对表达量信息,另外二级质谱中的肽段碎片离子峰质荷比反应了该肽段的序列信息;这些质谱原始数据经过数据库检索,可得到蛋白质的定性和相对定量信息。
二、 无标记定量蛋白质组
基于质谱标记定量蛋白质组学应用范围比较广泛,美中不足标记试剂成本和样本制备较为复杂,复杂样本中处理的重复精度受限。直接通过MS信号进行定量的技术(label-free quantification)就很好的解决了这个问题,label-free的技术不需要昂贵的标记试剂,基本适合各种类型样本进行定量,也广泛的应用于定量蛋白质组学的研究。
基于质谱无标记定量的蛋白质组学按照定量原理基本上可以分为两大类:一类是基于离子流色谱峰(extracted ion current, XIC)的定量算法,第二类是基于谱图计数法(spectral counting, SC)进行蛋白峰度的相对定量
第一类:基于离子流色谱峰的定量算法的文章 Strittmatter E F et al
基于离子流色谱峰(extracted ion current, XIC):主要是在保留时间(retention time, RT)轴上,根据肽段母离子的质核比提取不同保留时间下相对应的信号强度并重新计算XIC,利用XIC的面积或信号强度加和作为肽段的定量结果。
第二类:基于图谱记数法定量的文章 Lundgren D H et al
基于谱图计数法(spectral counting, SC):根据质谱的原理,一个蛋白的丰度越高,酶切肽段丰度就越高,被质谱检测的概率就越高。
将某个蛋白鉴定的蛋白数图谱数作为衡量蛋白峰度的依据,提出谱图记数法,原理简单直观计算也比较方便,也广泛应用到无标定量的方法中。
无标记的定量蛋白质组根据实验的需求不同,可以选择不同的质谱数据采集模式,如数据依赖性采集模式(data dependent analysis,DDA)及数据非依赖性采集(data independent analysis,DIA)DDA的数据采集模式。
DDA的采集模式基于鸟枪法的原理,按照离子强度从高进到低采集母离子进行二级碎裂,其结果是有一定的随机性和强度依赖性。
DIA法在2000年首次提出来,它会将整个扫描范围分为若干个窗口,基本实现对所有MS2的信息进行连续性和无偏采集,最大限度的获取碎片离子信息,提高定量的准确度。
2012年基于SWATH与DIA的方法结合,并通过采用高分辨质谱和优化采集方案,实现了大样本队列的快速高通量分析。对于非标记的定量蛋白质组最新也提出 Direct DIA(Direct data independent analysis)以及4D-DIA(增加离子淌度维度信息)的方法,助力与蛋白质组学的定量以及蛋白翻译后修饰的分析。
以上我们基于质谱蛋白质组学定量进行了详细介绍,无论是有标记定量还是无标记定量都有一定优点和缺点,只有适合研究目的方法才是最好的方法。我们进行进行如下总结,希望对开展蛋白质组学的同学老师有一定的帮助。