质谱结果做蛋白质分析(蛋白质组学基础入门系列)

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前言

在前面的第二讲中，我们已经了解到质谱（mass spectrometer）作为一种称量分子”质量”的利器，能够对目标物进行定性和定量分析，具有高通量、高灵敏度、分析速度快等特点，几乎已成为科研及检测机构必备的神器，被广泛地用于各种领域。我们接着上一讲——蛋白质组学中样品制备流程，继续简要介绍质谱检测的一般过程。

样品引入

蛋白质组学领域中，质谱通常与液相色谱联用，达到进样和分离的目的。目前市面上的液相色谱仪型号众多，外观也各不相同，但内在主要构造和进样过程并无本质差别。水相和有机相（统称流动相）混合后通过高压泵注入，样品通过自动进样系统注入，并被流动相带入分析柱进行结合，随着流动相中有机相的比例逐步提升，分析柱中结合的蛋白被逐渐洗脱下来，最终到达质谱的前端——离子源。

（LC的基本结构和过程）

色谱仪中有一个非常关键的小部件——六通阀，可用于控制进样，切换样品和流动相的注入。

感兴趣的小伙伴如果理解了它的工作原理，相信对液相的进样过程会有更清晰的认识。

质谱检测

样品经过液相后，就会到达质谱进行检测，目前蛋白质组学中常用的质谱仪器主要有Sciex公司的TripleTOF，Thermo公司的Orbitrap系列，以及Bruker公司推出的目前4D蛋白质组学质谱新锐timsTOF系列。虽然不同型号的质谱外观各不相同，但其内部结构非常相似，都具有离子源（Ion source）、质量分析器（Mass analyzer）、检测器（Detector）三大部分。用于蛋白质组学检测的高分辨仪器中，通常会采用电喷雾离子源，并串联使用两个甚至更多不同的质量分析器。

（Orbitrap Exploris 480的硬件结构）

下面主要以Orbitrap Exploris 480为例，简要介绍一下质谱检测的大致过程：

首先，液相导入的样品会源源不断地经过电喷雾离子源（Electrospray Ion Source），在高电压下雾化成带电液滴。带电液滴中的溶剂迅速被气化，液滴体积逐渐缩小，其电荷密度超过表面张力极限时会引起液滴“库仑爆炸”。随着溶剂进一步蒸发，最终形成带正电荷的气态肽段离子。

气态肽段离子随即进入高容量离子传输管（High Capacity Transfer Tube）和电动离子漏斗（Electrodynamic Ion Funnel），这个过程可捕获和聚焦离子并进行离子传输。

离子通过离子传输管和离子漏斗之后，会进入轴向弯曲设计（能防止中性或不需要的离子进入四极杆，从而提高稳定性降低噪音）的主动离子束传输系统（Advanced Active Beam Guide ）和分段式四极杆（Advanced Quadrupole Technology），四极杆可通过施加直流电压/射频电压，从而实现对离子的选择和传输，也是目前主流质谱仪通常串联使用的第一个质量分析器。

随后，离子会被转移至弯曲线性阱（C-trap），与氮气发生碰撞而失去动能，从而得到冷却，同时C-trap会通过其轴线上产生的电势阱，将离子挤压进质谱的核心部件——Orbitrap质量分析器（Orbitrap Mass Analyzer）中。

在离子阱质量分析器中，肽段离子或碎片离子会在电场作用下会围绕中心电极的径向和轴向做谐波振荡，由检测器检测各个离子的共振频率和信号强度，根据傅里叶变换公式根据共振频率计算各离子的质荷比，从而绘制形成一级谱图和二级谱图。除了Orbitrap质量分析器，在TripleTOF和TimsTOF系列使用的飞行时间质量分析器（Time-Of-Fly Mass Analyzer）中，不同质荷比的离子具有不同的飞行速度，因此到达检测器的时间不同。检测器会检测不同离子的飞行时间和信号强度，计算离子质荷比后绘制质谱谱图。

至此，质谱基本完成一个扫描循环中的一级全扫描分析（Full Scan Analysis），得到一级质谱图（MS1 spectrum）。

进行完一级扫描后，质谱随即通过四极杆，选择特定的肽段离子，经过C-trap进入多级离子通道（Ion Routing Multipole），通过高能碰撞解离（high energy collision dissociation，HCD）将肽段离子的肽键随机断裂形成b/y离子，返回C-trap之后，离子被注入 Orbitrap进行二级质谱分析（MS/MS Analysis）。

如果是DDA扫描模式，会根据本次扫描循环中采集到的一级谱图，选择信号较高的肽段离子依次破碎采集二级谱图。如果是DIA扫描模式，则会根据预设的质荷比窗口，选择一定质荷比范围内的所有肽段离子进行破碎和采集二级谱图；而若是PRM扫描模式，则是选择确定好的特定质荷比的肽段离子进行破碎和采集二级谱图。

质谱检测完整的数据采集过程由很多扫描循环组成，每个样品的检测总时间与其串联的液相色谱中样品洗脱梯度时间保持一致。如下图DDA扫描模式所示，每个扫描循环会采集一张一级谱图和数十张二级谱图。

（数据依赖采集，DDA）

总结