宏基因组概念 宏基因组是什么

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宏基因组简单来说就是将我们感兴趣的环境样本微生物总DNA提取出来，后续对总DNA进行测序，最后基于测序结果进行序列的组装、基因预测和物种和功能注释，从而了解该环境样本中的微生物的群落结构、物种分类、系统进化、基因功能及代谢网络等。那么宏基因组项目怎么做？方案设计怎样建立思路？诺禾致源十年测序经验分享给大家一些宏基因组研究中常用的研究思路～

研究思路

包括：多个样本的比较宏基因组、单样本宏基因组大数据量研究、16S+宏基因组研究、宏基因组+宏转录组的多组学联合研究。

举例如下：

1.比较宏基因组

研究目的：不同环境、不同处理、不同时间节点的样本中微生物群落结构和功能的差异，以及和环境因子的关系。

策略：至少一个处理组+一个对照组，每组至少3个生物学重复，推荐5-10个重复。

分析点：物种分类、功能基因和代谢通路的差异；统计学比较；差异显著性验证。

典型案例解析：

Alterations of the human gut microbiome in liver cirrhosis[1]

发表期刊：Nature（2014）

影响因子：42.351

肝硬化；肠道微生物；宏基因组；功能分类；代谢通路

材料选取：

98例肝硬化病人及83例健康人粪便样本，共181例中国人粪便样本。

研究策略：

文库片段长度275 -450 bp，PE100进行宏基因组测序，共产生858 GB数据，人均4.74 GB数据量。

主要结果：

肝硬化基因集中包含269万个非冗余基因的基因集，其中36.1%（97万）的基因为首次发现；通过与欧洲人、美国人及中国糖尿病三个基因集比较发现794,647个基因为肝病特有的；通过基因标记物的聚类分析发现28种细菌与肝硬化密切相关，其中多个细菌在肝硬化患者中首次发现，可作为肝硬化的生物标记物，同时发现38种细菌在健康人中富集；本研究建立了根据15个基因标记物来区分健康人与肝硬化患者，并在样本中得到验证。

图1 肝硬化病人肠道微生物相关性网络图

2.单一宏基因组

研究目的：针对稀有、珍贵样本，深入研究其中难分离难培养的微生物，得到单株菌的基因组信息。

研究策略：一个典型的环境样本，测大数据量（一般＞100G）。

分析点：序列拼接和组装。

典型案例解析

Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen[2]

发表期刊：Science（2011）

影响因子：31.48

奶牛瘤胃；宏基因组；大数据量；不可培养菌草图；外源表达；单细胞测序验证

材料选取：

将含柳枝稷（富含植物纤维，属于全球热门能源作物）的特殊装置种植进牛瘤胃中，待牛消化一段时间后，对粘附在装置中的食物残留物提取DNA。

图2 样本处理

主要结果：

鉴定出27,755个与碳水化合物相关的基因，从中挑选出90个基因进行外源表达，获得的90个蛋白质中，约57%的蛋白对富含纤维素的底物具有消化活性；利用Illumina测序通量高的优势，成功组装了15个不可培养的微生物基因组草图，并通过单细胞全基因组的方法进行了验证。

图3 瘤胃微生物基因组组装机代表性基因分析

3.多组学结合

研究目的：从基因组层面、转录表达层面以及代谢层面研究环境样本中微生物群落的功能。

策略：多组样本进行扩增子、宏基因组、宏转录组测序分析，GC-MS、LC-MS或NMR研究代谢产物。

分析点：微生物多样性、功能研究、代谢组数据结合分析。

典型案例解析

Human gut microbiome viewed across age and geography[3]

发表期刊：Nature（2012）

影响因子：41.45

肠道微生物；人粪便；16S；宏基因组；菌群功能

材料选取：

拉丁美洲委内瑞拉亚马逊地区、非洲东南部马拉威乡村、美国大都市三个地区，共531例健康的儿童和成人体粪便样本

研究策略：

该研究用16S 的方法鉴定了531 个粪便样品的细菌物种， 并选取其中的110 个样品用宏基因组的方法分析了基因成分。

主要结果：

0 到3 岁肠道菌群功能变化的趋势相同，其中维生素生物合成和代谢相关的基因随年龄变化的特征也相同。美国居民与另外两个国家细菌组成和功能基因集明显不同，在婴儿期和成人期差别都很明显。研究结果进一步表明在研究人体发育、营养需要、生理变化、西化影响的时候，需要考虑微生物群落变化的作用。

图4 三类群体中婴儿粪便微生物功能的差异

Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach[4]

发表期刊：Gut Microbes（2013）

影响因子：13.319

材料选取：

不同的时间点从使用β-内酰胺类抗生素人群的粪便样本

研究策略：

采用多种组学分析相结合的方法分析使用抗生素治疗 14 天的患者每天的粪便中肠道菌群的 16S rDNA、宏基因组学、宏转录组学（mRNAs）、宏代谢组学（方法：高效液相色谱与电喷雾电离作用和四极飞行时间质谱分析）、宏蛋白质组学（方法：超高效液相色谱法结合轨道阱质谱分析）。

主要结果：

本研究观察到一个动态往复的过程：肠道菌群组成以及代谢水平改变在抗生素使用第 6、11、14 天最为剧烈；将研究结果总结成一个“推定性”模型，该项结果证实，在应用抗生素针对某一特定细菌感染引起的相关疾病进行治疗时可以改变整个肠道的微生物环境以及该微生态系统与宿主之间的相互作用，而且这一影响是巨大的，远远超过我们当初的认识。

图5 受抗生素应用影响的人肠道菌群及代谢成分改变的“推定性”模型

1.Qin N, Yang F, Li A ,et al. Alterations of the human gut microbiome in liver cirrhosis. Nature. 2014, 513: 59-64.

2.Hess M, Sczyrba A, Egan R,et al. Metagenomic discovery of biomass- degrading genes and genomes from cow rumen. Science. 2011, 331(6016): 463-467.

3.Yatsunenko T, Rey FE, Manary MJ, et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 2012, 486(7402): 222-227.

4.Pérez-Cobas AE, Gosalbes MJ, Friedrichs A, et al. Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach. Gut Microbes. 2013, 62(11): 1591-1601.